Мои приключения с растениями продолжаются. Я выращиваю настоящий васаби в Москве и планирую построить для него целую ферму. Сейчас я озабочен поиском посадочного материала для своей фермы, но купить рассаду настоящего васаби в России невозможно, её нет физически. Поэтому я решил производить её самостоятельно. И не абы как, а с помощью микроклонального размножения. Для этого я из подручных средств организовал себе лабораторию, о ней и будет этот пост.

Что такое микроклональное размножение растений

Микроклональное размножение — это один из способов вегетативного размножения растений, т.е. новая особь образуется из многоклеточной части тела родительской особи. В основе микроклонального размножения лежит понятие тотипотентности, способности клетки путем деления дать начало любому клеточному типу организма. Представьте, что вы срываете ветку растения, ставите её в воду и она пускает корни. Вы создали условия, способствующие генерации новых органов. Микроклональное размножение производится в стерильных условиях, что позволяет расширить спектр возможных вариантов воздействия на ткани растения и получать новые органы из довольно неожиданных структур. Например, хризантема отлично размножается из лепестков. Или, к примеру, клетки растения можно заставить делиться без дифференцирования, получая каллус, который так же способен дать начало целому растению.

Приведу пример, как буду использовать микроклональное размножение для своих целей. Сначала я извлеку из материнских растений настоящего васаби почки, продезинфицирую их в специальном растворе, который убьёт на поверхности растения все бактерии и споры грибов, а затем в стерильных условиях помещу эти почки на специальную среду с фитогормонами и витаминами. Когда почка подрастет, я изменю гормональный состав, чтобы он способствовал генерации новых побегов.

Где-то через месяц я получу на каждой почке около трёх микро-побегов. Каждый их этих побегов можно отделить и вновь посадить на такую же среду и каждый из них через месяц снова даст около трёх побегов. А теперь посчитайте, сколько копий растения можно получить таким образом за год? 3 в 12 степени = 531441!

За этапом размножения следует этап генерации корней. Для этого побеги сажаются на среду с новым гормональным рецептом, стимулирующим корнеобразование. После того как корни будут готовы, растения отправляются на акклиматизацию, ведь они росли в стерильной среде и им нужно постепенно адаптироваться к настоящим условиям.

Почему микроклональное размножение?

Для чего такие сложности, ведь васаби можно размножать семенами и отростками?

Размножение семенами — это рабочий способ, но у него есть ряд недостатков. Семена васаби очень быстро утрачивают жизнеспособность и долго не хранятся, поэтому появляется зависимость от сезонности. Семена можно собрать и посадить раз в году в течение непродолжительного времени, а я хочу иметь возможность сажать растения в любое удобное время. Ещё одно неудобство — семена требуют стратификации (продолжительного периода охлаждения). У меня дома растет два сорта васаби и тот, что наиболее интересен за год так ни разу и не зацвёл.

Размножение отростками допустимо, и я не буду им пренебрегать. Но у него есть существенный недостаток. Отросток накапливает в себе болезни родителя и такой способ не рекомендуется проводить глубже, чем на три поколения. Микроклонирование же лишено этой проблемы, благодаря размножению в стерильных условиях. Остаются лишь вирусы, но и от них существуют техники лечения.

При микроклональном размножении я всегда буду иметь фонд посадочного материала, который легко контролируется и не зависит от внешних условий. Ну и в конце концов попробовать без какого-либо опыта организовать такую штуку — это интересно!

Помещение

У меня лаборатория распределилась по двум локациям. Некоторые вещи мне удобно делать дома, например, замешивать растворы или производить стерилизацию, ну а другие лучше там, где у меня есть свободная площадь, а именно в моей бытовке, которая осталась после клубничной фермы. Там, например, я разместил ламинарный бокс и шкаф для выращивания микро-клонов.

Ламинарный бокс

Ламинарный бокс — это главное место лаборатории. Он нужен, чтобы обеспечить стерильность проводимых работ. Достигается она за счет постоянного притока воздуха, который нагнетается через фильтр абсолютной очистки. Обычно используются фильтры HEPA не ниже класса H14. На вторичном рынке возможно найти профессиональный ламинар, начиная от 150 т.р. Я же собирал самостоятельно и это значительно дешевле. Мой ламинар состоит из следующих компонентов.

Предварительный фильтр. Класс F5, размер 287х287х48

HEPA-фильтр H14, 305х610х150. У меня это самая дорогая часть ламинара. Сейчас я считаю, что толщина в 150 мм — это много. Можно было сэкономить и заказать тоньше.

Центробежный радиальный вентилятор на 800 м³/ч. Его хватает с избытком для прокачки воздуха с нужной скоростью через мои фильтры. Если у вас будут другие фильтры, советую сделать расчет производительности вентилятора. Рекомендуемая скорость потока на выходе из фильтра 0.4-0.6 м/с. Вот ссылка на видео, где подробно рассказано, как произвести расчеты.

Корпус собирался из мебельной фанеры. Спереди установил подъемную крышку из закаленного стекла.

В ламинаре есть УФ-лампа для дезинфекции. Она должна быть установлена таким образом, чтобы свет падал на рабочую поверхность. У меня мощность лампы 8 вт. Это меньше, чем в стандартных ламинарах, но компенсируется временем экспозиции. Я запускаю стерилизацию минимум на 1 час перед работой. В планах поставить лампу помощнее. Кстати, во время работы УФ-лампу не включают, а то бывают и такие.

Имеется дополнительное освещение для работы. Удобно в ламинар встроить пару розеток, чтобы подключать оборудование.

Принцип работы ламинара следующий. В боксе №1 спрятан радиальный вентилятор, который через предварительный фильтр всасывает воздух и закачивает его в бокс №2. Бокс №2 в высоту около 30 см и нужен для выравнивания давления. Бокс №3 - это короб с фильтром HEPA. После фильтра выходит очищенный воздух, в потоке которого можно работать в стерильных условиях.

Все швы у ламинара промазаны герметиком, чтобы воздух нигде не сифонил.

После запуска ламинар был протестирован на стерильность. В течение 10 минут я держал открытыми банки со стерильной питательной средой. Потом убрал их на полку и ждал, что вырастет. Не выросло ничего. Если такую банку подержать вне ламинара, то на среду попадет множество бактерий и спор грибов, которые на ней активно размножатся. Так же эффективность подтверждена уже более чем 1000 банок, в которых я пытался ввести в культуру васаби и некоторые другие растения.

Шкаф для выращивания эксплантов

Я ещё не вводил понятие экспланта. Эксплант — это группа клеток, кусочек отделенный от материнского растения, используемый для дальнейшего размножения в стерильной среде. Чаще всего такие экспланты помещаются на питательную среду в герметичные контейнеры, банки, пробирки, чашки Петри. В общем, во что угодно, что подходит по размеру, обеспечивает стерильность, пропускает свет и не портится при автоклавировании.

После того, как эксплант помещен в контейнер (ещё говорят введен в культуру in-vitro), он отправляется в большинстве случаев в шкаф для дальнейшего развития, в зависимости от гормонов, которые были использованы, например на генерацию новых побегов. Для этого экспланту нужно создать подходящие условия: обеспечить освещение 3000 люкс, поддерживать режим день/ночь, и держать температуру около 24℃. Условия могут отличаться, в зависимости от требований. Каллус (недифференцированные, потерявшие специализацию клетки), например, можно выращивать в темноте.

Для своих эксплантов я собрал стеллаж, наклеил светодиодных линеек и подобрал блок питания, чтобы обеспечить около 3000 люкс на уровне банок с эксплантами. Ну а температура в 24℃ поддерживается во всем помещении за счет кондиционера и обогревателя.

Удаленное управление

Естественно, не обошлось и без автоматизации. В этот раз я использовал Raspberry Pi + Home Assistant и готовые устройства на Zigbee. Очень удобно из дома включить УФ-лампы для дезинфекции, а затем проветрить помещение, запустив принудительную вентиляцию. А так же включить сухожар для дезинфекции инструмента. По приезду в лабораторию, всё уже готово к работе.

Отделение для акклиматизации эксплантов

Когда у эксплантов будут выращены все органы, их можно перемещать из стерильной среды в наш агрессивный мир со всеми его вирусами, бактериями и грибами. Чтобы этот переход был мягче и больше эксплантов выжило, им сначала создают промежуточные условия. Экспланты отмываются от желеобразной среды и пересаживаются на стерильный субстрат. Влажность в самом начале обычно высокая и затем постепенно снижается, растения переводятся на слабое минеральное питание. В отделении акклиматизации стерильность уже не поддерживается, но чистота важна.

Оборудование

Автоклав

Автоклав нужен для стерилизации предметов и веществ, используемых в лаборатории. У меня самый частый пациент на автоклавирование — это среда, на которой растения вводятся в стерильную культуру. За счет нагрева водяного пара под давлением увеличивается температура и, соответственно, скорость и качество стерилизации. При температуре 121°C достаточно 15 минут, чтобы получить стерильную среду.

В качестве автоклава можно использовать скороварку или мультиварку с режимом скороварки. Но у них небольшой объем. Для меня оптимальным вариантом оказался бытовой автоклав, какие используют для консервирования продуктов и модифицируют под варку самогона. Я купил самый дешевый вариант с ТЭНом и повесил на него регулятор напряжения.

Если объема бытового автоклава мало, можно обратиться к интернет-барахолкам и найти что-то под себя, например, советские ВКУ-50 или ВК-75.

Стерилизация методом фильтрации

Не все жидкости можно нагревать без потери свойств. Например, фитогормоны и витамины автоклавировать не стоит. Для их стерилизации пользуются методом фильтрации. Например, мембранный фильтр на 0,22 мкм способен задержать большинство бактерий и грибов. Сначала я пользовался вот таким аппаратом:

Где синяя ручка закладывается мембранный фильтр, а затем из нижней части откачивается воздух, заставляя жидкость проходить через фильтр. Аппарат неудобен тем, что он большой и перед работой его самого надо простерилизовать. И без мытья нельзя другую жидкость прогнать. А мыть в стерильных условиях неудобно, если вообще имеет смысл. Но есть решение! Одноразовые фильтры на шприц. Стоят недорого и крайне удобны в использовании. После них я забыл про фильтровальный аппарат.

Магнитная мешалка с подогревом

Очень полезная вещь, когда нужно что-то в чем-то растворить или постоянно перемешивать. Для нее можно купить магнитных якорей разных размеров, под любую тару. Хотя я использую только два размера - тот, что на фото для объемов 0.1 - 2 л и совсем малюсенький для мелкой тары.

Микроскоп

У меня их два. Первый - это стерео-микроскоп 7x-50x для работы с мелкими частями растения. У него достаточно пространства под объективом, чтобы комфортно работать пинцетом и скальпелем, а бинокулярность помогает ориентироваться в пространстве. Например, достать у растения меристему без такого микроскопа будет очень сложно.

Второй микроскоп с увеличением до 1000x, чтобы было видно грибы и бактерии. Мне он нужен для помощи в борьбе с внутренним бактериальным заражением эксплантов.

Естественно, если вы не знаете пока, как именно будете применять микроскоп, то раньше времени его покупать нет смысла. Оба микроскопа я брал на алиэкспрессе и ни о чем не жалею. Пока изучал микроскопную тему, пришел к выводу, что по соотношению цена/качество это лучший вариант.

Пипетатор

Очень удобный прибор для точного дозирования небольших объемов жидкостей. Позволяет работать в стерильных условиях за счет сменных наконечников. Я его использую в основном для добавления фитогормонов в питательную среду. У меня в ходу прибор с рабочим диапазоном 10-100 мкл. Покупал на маркетплейсе китайский вариант относительно недорого. Делал замеры, как работает прибор. Погрешность не критическая, в соответствии с паспортом. Пипетатор можно заменить инсулиновыми шприцами на 0.3 мл, но прибор всё же точнее и в глобальной перспективе выгоднее за счет копеечной стоимости одноразовых наконечников.

Очистка воды

При приготовлении различных растворов, важно, чтобы вода не содержала примесей, которые могут непредсказуемо прореагировать с растворяемыми веществами или оказать негативное влияние на экспланты. Проще всего для очистки воды собрать установку на основе обратного осмоса. Например, взять обычную бытовую, состоящую из предфильтров и обратноосмотической мембраны и выкинуть минерализатор.

Мерная посуда

Мерной посуды у меня много разной, хотя самая ходовая - колбы на 0.5 л, в них я автоклавирую питательную среду и емкости на 2 литра, в которых что-то часто замешиваю. Так же всегда в ходу шприцы самых разных мастей

Весы

У меня есть кухонные весы для крупных навесок и 3 ювелирных: до 50 гр, до 200 гр и до 500 гр. Самые ходовые на 200 гр.

Скальпель и пинцет

Неразлучные друзья для работы с эксплантами. Скальпель лучше всего иметь со сменными лезвиями. Они достаточно быстро портятся во время работы, когда приходится их стерилизовать в пламени спиртовки после каждого отреза. Кстати, из-за стерилизации под огнем удобнее работать сразу двумя наборами скальпель-пинцет. Стерилизация после каждого отреза утомляет, так еще и дождаться надо, пока приборы остынут. Поэтому удобно чередовать - одними работаешь, другие остывают.

Спиртовка

Спиртовку я использую для дезинфекции скальпеля и пинцета, концы которых окунаю в спирт и затем обжигаю в пламени. Во время работы с растениями рекомендуется проводить дезинфекцию после каждого отреза, чтобы не размазывать заразу, если она случайно попадется при работе.

Сухожар

Это такая электро-духовочка для стерилизации предметов. После завершения работы я убираю в нее инструмент. А когда планирую поработать в следующий раз, то удаленно включаю за час до начала использования.

pH-метр

pH рабочих жидкостей не всегда соответсвует требованиям и его необходимо корректировать. Например, я самостоятельно изготавливаю среду Мурасиге-Скуга, и изменяю её pH в соответствии с протоколом микроразмножения.

В серьёзных лабораториях обычно используются дорогие устройства, но и точности простых бытовых pH-метров вполне хватает. Тем не менее, я взял себе за правило калибровать прибор перед каждым использованием в случаях, где особенно важна точность.

Холодильник

Многие вещества лучше хранить в холодильнике, а другие в морозильной камере. Например, я заранее приготовил стерильных растворов фитогормонов, витаминов и антибиотиков. Сначала я держал всё в отдельном углу семейной морозилки, но быстро принял решение обзавестись отдельным холодильником под свои нужды. Так спокойнее и за семью и за вещества.

Пульверизатор

Брызгалку я использую постоянно. В ней у меня залит 70% спирт. Обрабатываю ей рабочие поверхности и предметы, которые вношу в стерильный бокс. А еще руки во время работы в стерильных условиях.

Расходники

Спирт

Без спирта никуда. В первую очередь это дезинфецирующее средство, причем не только для рабочих поверхностей, но и для эксплантов. Это и топливо в спиртовках и возможный растворитель для некоторых фитогормонов. Очень жаль, что ограничена свободная продажа, но ищущий да обрящет.

Вода

Имеется в виду вода без примесей, деионизированная. Выше я писал как её можно получить.

Среды для растений

Существует множество различных сред, самая популярная из них — Мурасиге-Скуга (MS). На самом старте я рекомендую покупать готовые среды проверенных производителей. Я на этом обжегся, когда свою первую среду купил на алике. Месяцы экспериментов были потрачены впустую из-за того, что экспланты гибли на этой среде, а я не понимал почему.

Если чувствуете в себе силы, то среду несложно приготовить самостоятельно из навесок солей. Все соли есть в свободной продаже, а рецепты доступны в сети. На фото ниже набор моих солей для приготовления основы среды MS.

Кроме минеральных солей в состав сред входят витамины. Их тоже можно смешать самостоятельно. Но если купить профессиональную смесь, например, такую, то её хватит надолго и стоит она не дорого, а в цепочке производства будет исключен рискованный элемент.

Фитогормоны

Используются в микроскопических дозах. К примеру, 1 г гормона 6-БАП (6-Бензиладенин, 6-Benzylaminopurine) хватит на 1000 литров среды при довольно сильной концентрации в 1 мг/л. В сети один ресурс, где продают гормоны за дешево физлицам, но у меня нет уверенности, что там товар качественный или хотя бы рабочий. Буду очень признателен, если кто-нибудь расскажет в комментариях о своем опыте с фитогормонами от greenagrolab. Я пока боюсь их использовать и через ИП закупился у проверенного поставщика.

Баночки

Тара для жизни кусочков растений в стерильных условиях подбирается индивидуально, в зависимости от размеров и подхода. У меня сейчас самая ходовая единица - пластиковые соусники на 30 мл. т.к. почти все мои экспланты имеют бактериальное заражение, я их сажаю изолированно в маленькие баночки, чтобы не заразили друг друга. Как только мне удастся получить здоровый экземпляр, я возьму тару покрупнее и буду сажать по несколько единиц в банку.

Пакеты для автоклавирования

Существуют самых разных размеров. После автоклавирования предмет надо как-то в стерильном виде доставить до ламинарного бокса. Поэтому он автоклавируется в специальном пакете.

Фольга

Используется для тех же целей, что и пакет для автоклавирования. Предмет перед отправкой в автоклав плотно заворачивается в фольгу, а при внесении предмета в ламинар фольга снимается.

Пробирки типа Эппендорф

На 1.5 мл. В них удобно порционно разливать стерильные растворы фитогормонов, чтобы, в случае заражения или порчи не пострадал большой объем.

Наконечники для пипетатора

Наконечники одноразовые. Стоят недорого. Можно купить, например, пакет на 1000 штук и долго не переживать, что закончатся. Удобно купить к ним штатив, чтобы герметичный был и выдерживал стерилизацию в автоклаве. Наконечники обычно продают не стерильными. Обычно заряжают такой штатив и автоклавируют.

Шприцы

Шприцы расходуются у меня активно. Удобно, что они стерильны. Шприцами я постоянно что-то отмеряю, переливаю или отсасываю. И даже один раз при помощи шприца пробовал заниматься вакуумной инфильтрацией, чтобы доставить вещество в ткани растения.

Сменные насадки скальпеля

У меня в ходу ручка скальпеля хирургическая №3 и сменные одноразовые лезвия №11 к ней.

Средства для дезинфекции эксплантов

Чтобы выращивать эксплант в стерильной среде, он и сам должен быть стерильным. Существует множество средств для стерилизации поверхности эксплантов. В большинстве протоколов микроклонального размножения указывается, какие средства были использованы. Самое популярное вещество — гипохлорит натрия. Содержится в белизне и её можно использовать. Работая с ней надо очень аккуратно подбирать концентрацию, т.к. содержание гипохлорита натрия сильно плавает у разных производителей. И не факт, что от партии к партии будет одинаковой. Вот есть прекрасный пост о белизне.

Среди прочего может использоваться спирт (чаще как предварительная обработка до основной стерилизации), перекись водорода, хлорид ртути (сильный яд, лучше не иметь с ним дело, когда есть альтернативы) и т.д.

Я же подсел на самодельный аналог средства Plant Preservative Mixture (PPM™). В его составе биоцид, который в слабых концентрациях убивает бактерии и грибы и в то же время достаточно щадящим образом относится к тканям растений. В целях профилактики заражений это средство даже можно добавлять в среду к растениям и оно не теряет своих свойств при автоклавировании.

Что дальше, если заинтересовала тема?

О том, как конкретно заниматься микроклональным размножением в сети полно информации. Можно поизучать немного теории. На ютубе много видео с процессом работы. Внимательно смотрите и учитесь. Там ничего сложного.

Если у вас есть желание размножать конкретное растение, то наверняка до вас уже это кто-то делал. И скорее всего для этого растения в сети найдется не один протокол микроразмножения и написана уже не одна научная статья о том, как его клонировать. Особенно в англоязычном сегменте интернета.

Уделяйте особое внимание стерильности и правилам работы во время размножения. Я рекомендую отдельно на эту тему погуглить, поспрашивать у дипсика и чатагпт, как делать правильно и на что обратить внимание. В видеороликах тоже об этом рассказывают.

Качество препаратов в микроклональном размножении играет важную роль. Если покупаете дешевый аналог, то как минимум надо провести одновременное сравнение с качественным препаратом, и только если не видно разницы, то зачем платить больше, а иначе лучше платить.

Точность имеет большое значение. На каждом этапе нужно тщательно следить, что было отмерено нужное количество вещества, что pH среды действительно соответствует требованиям и хотя бы один раз проверить, как он меняется после автоклавирования (а он меняется) и учитывать это в будущем. Отклонения от нормы вредят эксплантам.

Думайте о своей безопасности. В научных статьях частенько можно встретить применение опасных для здоровья веществ. Многие без проблем можно купить в сети. Если пробуете что-то новое, убедитесь, что оно вам не навредит.

Какие успехи у меня

Микроклональное размножение васаби

На фото эксплант васаби, выросший из кусочка тканей, размером не больше 1 мм. К сожалению, он заражен и скорее всего скоро погибнет. Материнские растения, из которых я беру образцы для введения в культуру имеют внутреннее бактериальное заражение с которым я не могу пока справиться. Борьба с заражением — это тема для отдельного поста. Я провел уже более 50 экспериментов, пробовал и различные антибиотики и меристему доставать и много чего ещё. Пока все мои попытки заканчиваются неудачей, но если посмотреть на весь прогресс от первой попытки до последней, то я здорово прокачался в работе с бактериальным заражением. Буду работать дальше. Я не оставляю надежды побороть заразу.

Клубника

А вот с клубникой всё получилось с первой попытки. На фото выше 5 банок. Изначально я посадил в банки 5 семечек. Благодаря фитогормонам они раскустились и имеют маленький размер. Эти кустики я разделил на микро розетки и рассадил. Теперь у меня 60 банок. Такими темпами в следующий раз должно получиться 720. А дальше по геометрической прогрессии.

Понятия не имею, что я буду делать с такой кучей растений. Если у кого-то есть интерес к здоровой рассаде топовой клубники Delizzimo F1, пишите, договоримся.

Скоро буду пробовать подбирать для эксплантов гормоны для генерации корней, а затем высаживать на адаптацию к жизни в обычных условиях.

Плесень для сыра

Я очень люблю сыр с плесенью. После ухода в 2014 году с российского рынка иностранных сыров с голубой плесенью никто до сих пор не научился его делать нормально. По крайней мере в обычных магазинах невозможно купить достойной продукции. Есть контрабанда. Однажды я купил вкусный контрабандный итальянский сыр и загорелся идеей достать из него плесень и сделать свой собственный сыр. Ведь у меня же есть лаборатория, в которой я смогу выделить культуру плесневых грибов Penicillium roqueforti из этого сыра и выращивать её. Сказано - сделано! Теперь у меня растет голубая плесень.

Молочнокислые бактерии тоже можно выделить из сыра, но тут работка посложнее, т.к. в вызревании сыра с голубой плесенью участвует 3-4 вида бактерий и их нужно идентифицировать и разделить. Я оставил это до лучших времен и купил пока готовую бактериальную закваску. И вот у меня к Рождеству целая куча собственноручно приготовленного сыра с голубой плесенью.

Тема оказалась очень интересной. В первой версии сыра я уже выделил несколько вещей, над которыми надо поработать и у меня уже вызревает 4 новых разных версии сыра и ещё 2 эксперимента запущу вот-вот.

Итого

Лаборатория функционирует прекрасно, я счастлив. Основная задача, ради которой это всё затевалось до сих пор не решена. У меня всё ещё нет посадочного материала для моей васаби-фермы. Но зато появились побочные квесты, где тоже можно прокачаться. А с бактериальным заражением эксплантов я рано или поздно разберусь.

О дальнейшей судьбе васаби, сыра и клубники следите на моем канале.